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那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（四）：

固定相上結(jié)合的蛋白質(zhì)要用可破壞結(jié)合作用力的溶劑條件進(jìn)行洗脫。這些流動(dòng)相的條件要根據(jù)層析類(lèi)型和目標(biāo)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來(lái)選擇。蛋白質(zhì)洗脫方法通常包括以下三種：批次洗脫，階梯式洗脫和線(xiàn)性梯度洗脫。如何選擇*好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來(lái)決定。
1、批次洗脫 - 一步即將所有結(jié)合蛋白質(zhì)一次性洗脫。基于特異性相互作用 （如親層析）的層析方法*好采用這種方式。批次洗脫法沒(méi)有任何分離效果，但它可以很好地快速去除雜質(zhì)。它需要事先了解取代目標(biāo)蛋白所需的緩沖液條件。
2、階梯式洗脫 - 連續(xù)進(jìn)行多步批次洗脫，并每次逐漸增強(qiáng)洗脫條件。在階梯式洗脫中，收集的組分?jǐn)?shù)取決于連續(xù)批次洗脫的次數(shù)。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好，但比線(xiàn)性梯度洗脫的效果要差。
3、線(xiàn)性梯度洗脫 - 當(dāng)流動(dòng)相以線(xiàn)性梯度洗脫時(shí)可收集多種連續(xù)流出的組分。對(duì)于離子交換層析和疏水作用層析，線(xiàn)性梯度洗脫可以獲得*好的分離效果，同時(shí)，它還可以收集到大量的連續(xù)組分。
由于體積排阻層析中蛋白質(zhì)和固定相之間不存在相互作用，因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質(zhì)上樣后，無(wú)需改變洗脫緩沖液的條件，即可連續(xù)不斷地收集各分離組分至所有蛋白質(zhì)全部被洗脫為止理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續(xù)的層析柱，由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。

羥基磷灰石（羥基磷酸鈣）是*初在20世紀(jì)50年代中期描述的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。球形羥基磷灰石的商業(yè)可得性使羥基磷灰石柱色譜法成為可及的技術(shù)。蛋白質(zhì)與羥基磷灰石柱相互作用的機(jī)制是復(fù)雜的。蛋白質(zhì)*常用磷酸鹽梯度洗脫。羥基磷灰石與其他色譜技術(shù)具有不同的選擇性，因此可以對(duì)有難度的蛋白純化或作為*終“拋光"步驟提供有效補(bǔ)充。羥磷灰石層析已經(jīng)成功地用于治*療級(jí)抗體的純化。
色譜聚焦是一種基于其pI分離蛋白質(zhì)的柱層析法。蛋白質(zhì)結(jié)合到專(zhuān)門(mén)的離子交換介質(zhì)上并用pH梯度洗脫。色譜聚焦的選擇性不同于其他技術(shù)的選擇性，因此可用作*終的“拋光"步驟。

每一次柱層析分離完成后，收集的組分必須進(jìn)行分析以檢測(cè)其所含的目標(biāo)蛋白及各組分的相對(duì)純度。每一步之后都需要進(jìn)行該類(lèi)分析以確定哪些組分可以被合并用于下一步。為檢測(cè)純度，必須有一種方法能檢測(cè)出某種特定蛋白質(zhì)相對(duì)所有蛋白質(zhì)的含量。下列即為一些常用于純度分析的方法:
1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） - 一種基于蛋白質(zhì)尺寸不同來(lái)進(jìn)行分離的變性凝膠。市售染色劑可使樣品中所有蛋白質(zhì)顯色可見(jiàn)，可據(jù)此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純度分析（圖10）。SDS-PAGE不能對(duì)組分進(jìn)行大規(guī)模的分析，并且需要耗費(fèi)數(shù)小時(shí)。但由于易操作、經(jīng)濟(jì)且適用于所有蛋白，因此它仍然是一種*常用采用的方法。

圖 10. 蛋白質(zhì)純化工藝中收集的蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。

2、光譜分析 - 一種分析蛋白質(zhì)光學(xué)性質(zhì)的方法。這種用于蛋白質(zhì)純度分析的方法只適用于如細(xì)胞色素P450等具有*光學(xué)特征的蛋白質(zhì)。這一類(lèi)蛋白質(zhì)在某特定波長(zhǎng)（420 nm附近 [40] ）有吸收而其他蛋白質(zhì)沒(méi)有，因此比較它在420nm和280nm處 （該波長(zhǎng)處所有蛋白質(zhì)均有吸收） 的吸收，即可獲得該蛋白質(zhì)的純度信息。這個(gè)方法快速且可大規(guī)模操作，但僅使用于部分蛋白質(zhì)。
3、蛋白質(zhì)測(cè)活 - 一種目標(biāo)蛋白的酶活實(shí)驗(yàn)。這種測(cè)定蛋白質(zhì)純度的方法通常與其他蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法相結(jié)合以計(jì)算其相對(duì)整體蛋白質(zhì)濃度的活性?；钚詼y(cè)試只適用于活性可以被高通量方法如酶解測(cè)活的蛋白質(zhì)。對(duì)某些蛋白質(zhì)而言，活性測(cè)試提供了一種快速可靠的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。酶的測(cè)活是非常有用的，因?yàn)檫@樣在下一步應(yīng)用前即可先將失活的蛋白質(zhì)排除出去。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)純度已滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)研究的要求時(shí)，即可將其以合適的方式保存起來(lái)。*終保存用緩沖液的選擇和純化過(guò)程中選擇所用的緩沖液一樣重要，同樣依賴(lài)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和純化蛋白質(zhì)后續(xù)應(yīng)用所需條件來(lái)選擇。通常，因?yàn)樵赟EC層析過(guò)程中可以完成緩沖液的有效置換，因此它通常被安排為整個(gè)純化工藝的*后一步。純化的組分可以立即合并保存，或者*后合并的組分也可以透析為所選的緩沖液后再保存。
由于蛋白質(zhì)的保存條件取決于目標(biāo)蛋白本身，應(yīng)將其優(yōu)化至能長(zhǎng)期保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性的條件。在儲(chǔ)存條件下，保存緩沖液中通常會(huì)加入一些添加劑用于延長(zhǎng)純化蛋白的保存期。由于每種蛋白質(zhì)的表現(xiàn)各不相同，因此需要通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找*合適的保存條件。

細(xì)胞產(chǎn)生的約20-30％的蛋白質(zhì)是整合膜蛋白，并且約50％的小分子藥*物作用于膜蛋白質(zhì)。因此，針對(duì)解決膜蛋白結(jié)構(gòu)有極大的興趣。純化整合膜蛋白的關(guān)鍵步驟是它們從脂質(zhì)雙層的溶解，同時(shí)保留其功能完整性。典型的方法包括通過(guò)離心分離細(xì)胞內(nèi)膜，隨后洗滌劑溶解整合膜蛋白質(zhì)并高速離心以除去不溶性膜殘余物。
大量的洗滌劑已被用于膜蛋白溶解，并且在沒(méi)有文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室先例的情況下，研究者將需要憑經(jīng)驗(yàn)確定某特定蛋白質(zhì)的*佳洗滌劑。然后通過(guò)本質(zhì)上與可溶性蛋白相同的柱色譜法純化溶解的膜蛋白。然而，純化緩沖液將需包含洗滌劑以保持蛋白質(zhì)處于可溶狀態(tài)。膜蛋白的純化通常非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵趶闹|(zhì)雙層初步移除和通過(guò)各種純化步驟后蛋白質(zhì)功能完整性和聚集的常常喪失。近來(lái)，納米盤(pán)已經(jīng)成功地用于B家族GPCR的親和純化。
無(wú)論是蛋白研究還是應(yīng)用，通常需要將蛋白利用不同的生物系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)，然后進(jìn)行分離和純化。研究實(shí)驗(yàn)室通常需要純化微克或毫克級(jí)別的蛋白質(zhì)，而工業(yè)上需要純化數(shù)千克甚至數(shù)噸的蛋白質(zhì)。因此，蛋白純化非常重要。純化過(guò)程中，主要需要考慮宿主污染、樣品的可溶性、蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和生物活性。分享了以上蛋白純化的方法，希望對(duì)大家工作有所幫助。
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